Mae technolegau diagnostig moleciwlaidd heddiw yn esblygu ar gyflymder digynsail, gyda datblygiadau sylweddol dros y ddwy flynedd ddiwethaf. Yn eu plith, mae technolegau ymhelaethu isothermol wedi ennill mwy o sylw oherwydd eu gallu i berfformio ymhelaethiad heb yr angen am offer arbenigol. Mae sawl dull ymhelaethu isothermol adnabyddus yn bodoli, megis LAMP, RPA, ac RAA. Fodd bynnag, heddiw rwyf am gyflwyno technoleg ymhelaethu isothermol mwy newydd-mira.
Er mwyn sicrhau bod gan bawb ddealltwriaeth gyson o'r cysyniadau allweddol, dyma rai esboniadau tymor:
- Ymhelaethiad polymeras ailgyfuno (RPA): Mae hon yn dechnoleg ymhelaethu wedi'i chyfryngu gan ailgyfuno.
-Ymhelaethiad gyda chymorth ailgyfuno (RAA): Dull ymhelaethu wedi'i gyfryngu gan ailgyfuno tebyg.
- Ymhelaethiad isothermol wedi'i gyfryngu gan ddolen (LAMP): Techneg ymhelaethu isothermol arall.
- Ymhelaethiad Cyflym Isothermol Multienzyme (MIRA): Technoleg ymhelaethu cyflym isothermol newydd.
Crynodeb ac eglurhad cyflym:
Efallai y bydd llawer yn meddwl tybed pa un o'r amrywiol ddulliau ymhelaethu isothermol hyn sy'n fwy dibynadwy a sefydlog. Mewn gwirionedd, mae gan bob technoleg ei chryfderau a'i chyfyngiadau. Fodd bynnag, y ffactorau allweddol ar gyfer mabwysiadu'n llwyddiannus yw'r gallu i raddfa cynhyrchu yn ddibynadwy, cost isel, a pherfformiad cadarn ar draws cymwysiadau amrywiol.
Byddaf yn awr yn dadansoddi pob technoleg yn fyr yn seiliedig ar yr hyn rwy'n ei wybod:
LAMP (ymhelaethiad isothermol wedi'i gyfryngu gan ddolen):
Mae llawer yn y maes yn gwybod bod LAMP wedi tarddu o Japan, a ddatblygwyd gan Dr. Notomi yn 2000 fel techneg ymhelaethu genynnau newydd. Ar hyn o bryd, mae perchnogaeth y dechnoleg hon yn perthyn i'r cwmni Japaneaidd Eiken Chemical Co., Ltd.
Manteision:
- sensitifrwydd uchel (2-5 gorchmynion maint yn uwch na dulliau PCR traddodiadol).
- Amser ymateb byr (gellir cwblhau adweithiau mewn 30-60 munud).
- Nid oes angen offerynnau arbennig mewn defnydd clinigol (er bod tyrbidimedr amser real yn cael ei argymell wrth ddatblygu cit).
- Hawdd i'w weithredu (p'un a yw'n canfod DNA neu RNA, mae'r broses yn cynnwys cymysgu'r toddiant adweithio, ensymau, a thempled mewn tiwb adweithio, yna deori ar oddeutu 63 gradd ar gyfer 30-60 munud mewn baddon dŵr neu ddeorydd, gyda'r canlyniadau'n cael eu harsylwi gan y llygad noeth).
Anfanteision:
- Gall sensitifrwydd uchel arwain at halogi aerosol unwaith y bydd y tiwb wedi'i agor, gan ei gwneud yn anaddas i'w ddefnyddio y tu allan i labordy PCR oherwydd risg uchel o bethau ffug ffug.
- Mae dyluniad primer yn heriol, gan ei gwneud yn anaddas i rai afiechydon, yn enwedig y rhai a achosir gan firysau heb lawer o ddilyniannau cyffredin.
- Mae ei gymhwysiad yn gymharol gyfyngedig.
Technolegau ymhelaethu isothermol RPA a RAA:
Mae'r ddau ddull hyn yn homologaidd i raddau helaeth, a'r prif wahaniaeth yw ffynhonnell yr ailgyfuno a ddefnyddir.
- Daw ailgyfuno RPA o'r bacteriophage T4.
- Mae ailgyfuno RAA yn deillio o facteria neu ffyngau.
Pwyntiau allweddol o egwyddor gweithio:
1. Ym mhresenoldeb ATP, mae'r ailgyfuno yn rhwymo i brimynnau, gan ffurfio cymhleth asid protein-niwclëig, sydd wedyn yn chwilio am baru DNA targed.
2. Unwaith y bydd y primer yn dod o hyd i'r templed DNA sy'n cyfateb, mae hydrolysis ATP yn darparu'r egni i ailgyfuno adael y primer, ac mae polymeras DNA yn syntheseiddio llinyn DNA newydd.
3. Ar yr un pryd, mae proteinau rhwymo DNA un llinyn (SSB) yn rhwymo i'r llinyn DNA sydd wedi'i ddadleoli i atal diwygio'r llinyn dwbl.
Manteision:
- Mae'r adwaith RPA/RAA yn gyflym iawn, gyda'r canlyniadau'n gyraeddadwy mewn tua 30 munud.
- Gall sensitifrwydd gyrraedd 10 copi/μl.
- Nid oes angen offer cymhleth yn ystod ymhelaethu.
-Datblygu pellach dulliau cromatograffeg aur sy'n seiliedig ar stilwyr neu colloidal yn symleiddio dehongliad canlyniadau yn fawr, gan eu gwneud yn addas iawn i'w defnyddio mewn meysydd sydd â chyfyngiadau adnoddau neu dan anfantais economaidd.
Anfanteision:
- Mae RPA yn dechnoleg a ddatblygwyd gan y cwmni Prydeinig TwistDX, sydd bellach yn eiddo i Abbott, gan arwain at gostau uchel, cylchoedd cyflenwi hir, a diffyg cefnogaeth dechnegol. Mae hyn yn gwneud cymhwysiad ar raddfa fawr a chynhyrchu màs yn anodd yn Tsieina.
- Mae RAA yn dechnoleg ddomestig yn unig, ond nid oes ganddo sefydlogrwydd o ran ymwrthedd ymyrraeth a chysondeb ymweithredydd cynnyrch. At hynny, mae angen gwella'r broses weithgynhyrchu ar gyfer ensymau swyddogaethol. Er bod y dechnoleg wedi bod ar y farchnad ers pum mlynedd, nid yw wedi'i mabwysiadu'n eang eto oherwydd sefydlogrwydd ac materion amlochredd.
- Mae angen primers ar RPA a RAA sy'n 30-35 bp o hyd. Mae primers byrrach yn effeithio ar benodolrwydd, sensitifrwydd a chyflymder ymhelaethu, gan wneud dyluniad primer yn heriol.
Mira (ymhelaethiad cyflym isothermol aml -zyme):
Mae Mira yn dechnoleg ymhelaethu isothermol newydd a gyflwynwyd yng nghanol -2019. Mae'n homologaidd i RPA a RAA.
Er bod MIRA yn rhannu tebygrwydd ag RPA a RAA o ran egwyddorion gweithio, mae gwahaniaethau sylweddol o ran dewis ensymau, tyfu, puro, ac agweddau eraill ar gynhyrchu ar raddfa fawr. Ar ben hynny, mae'r tîm technegol y tu ôl i ddatblygwr Mira, AmpFuture, wedi treulio bron i 11 mlynedd yn perffeithio'r dechnoleg. Mae bellach wedi'i gyfarparu'n llawn i gefnogi datblygiad adweithyddion parod i'w defnyddio, datblygu arfer, prosiectau ymchwil, a gwasanaethau eraill y gellir eu haddasu.
Manteision:
1. Mae'r proteinau swyddogaethol mewn adweithyddion MIRA yn dod o amrywiol ensymau, gyda rhai ensymau yn cael eu haddasu wedi'u targedu i wella effeithlonrwydd y system ensymau craidd, gan arwain at system fwy cynhwysfawr.
2. Gwrthiant a sefydlogrwydd ymyrraeth gref. Mae adweithyddion MIRA yn cael eu optimeiddio'n helaeth o ran dewis a chanolbwyntio cofactor, ynghyd â phrosesau cynhyrchu rhewi sychu, gan eu gwneud yn fwy gwrthsefyll ymyrraeth ac yn fwy sefydlog.
3. Addasu ac amlochredd. Oherwydd rheolaeth lwyr dros gynhyrchu proteinau swyddogaethol a dealltwriaeth ddofn o'r dechnoleg, gellir addasu MIRA i amrywiol gymwysiadau, gan gynnig gwahanol systemau ymweithredydd a gwasanaethau addasu wedi'u personoli.
4. Patentau perchnogol. Gan fod MIRA yn cael ei ddatblygu'n ddomestig 100%, nid oes unrhyw risg o dorri patent yn ystod datblygu cynnyrch. Mae hyn yn rhoi mantais gystadleuol i Mira yn y marchnadoedd domestig a rhyngwladol.
5. Mae protocol cynhyrchu cyflawn wedi'i sefydlu, gan ganiatáu ar gyfer cynhyrchu sefydlog ar raddfa fawr.
Anfanteision:
1. Mae cydnabod y farchnad yn dal i fod yn isel, ac mae angen mwy o ddata a chyfeiriadau o wahanol feysydd (megis cyfraddau cadarnhaol mewn gwahanol feysydd) i gael eu derbyn yn ehangach.
2. Mae dyluniad primer yn dal i ddilyn nodweddion RPA neu RAA, sy'n gofyn am ddilyniannau primer neu stiliwr hirach, na fydd efallai'n hwyluso switsh cyflym ar gyfer defnyddwyr PCR cyfredol.