《Sefydlu dull canfod rhabdovirus micropterus salmoides yn seiliedig ar System CRISPR CAS13A Express
Zhang Minlin, Huang Fengqi, Zuo Xiaoling, Liang Jiantao, Liang Kaishan, Dan Jinhong, Li Zongyang, Yu Jie, Luo Liyuan, Xie Zijie, Xie Zijie, Zhao Huihong, Wang qing System Black3 ar gyfer Dull Basse3 System Chinese Journal of Hydrobiology, 2024, 48 (2): 283-291. Doi: 10.7541/2023.2023.0199
Mae Salmoides Micropterus, a elwir hefyd yn fas California neu fas du Americanaidd, yn bysgodyn dŵr croyw sy'n frodorol i Ogledd America. Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae wedi dod yn bysgodyn ffermio pwysig ledled y byd oherwydd ei alw uchel yn y farchnad: mae gan Micropterus salmoides gig cadarn, ychydig o esgyrn, blas blasus, maeth cyfoethog, yn enwedig protein uchel a braster isel, sy'n cwrdd â galw defnyddwyr am fwyd iach. Felly, mae pris y farchnad yn gymharol uchel ac fe'i defnyddir yn aml yn y farchnad arlwyo pen uchel. Twf Cyflym: Mae Salmoides Micropterus yn tyfu'n gyflym ac yn gyffredinol gall gyrraedd manylebau nwyddau mewn misoedd 6-8. Mae'n addas ar gyfer bridio cylch byr a gall wireddu enillion buddsoddiad yn gyflym. Gwrthiant Clefydau Cryf: O'i gymharu â physgod eraill a ffermir, mae gan Micropterus Salmoides addasrwydd cryf i'r amgylchedd, brigiadau llai o glefydau ar raddfa fawr, ac mae'n lleihau risgiau bridio. Bridio ecolegol: Gellir cymysgu draenogiaid y môr mawr â physgod dŵr croyw eraill fel carp arian a charp glaswellt, sy'n helpu i sicrhau cydbwysedd ecolegol pyllau a sicrhau'r defnydd mwyaf posibl o adnoddau, gwella effeithlonrwydd bridio a ffactorau eraill ymhellach. Mae croeso iddo gan bobl fwyta a ffermwyr dyframaethu, ac mae ei raddfa fridio wedi tyfu'n gyflym yn ystod y blynyddoedd diwethaf.
Er bod salmoidau micropterus yn gwrthsefyll afiechydon yn gymharol, gallant ddioddef o rai afiechydon o dan amodau bridio gwael o hyd. Yn eu plith, mae micropterus salmoides rhabdovirus (MSRV) yn hynod niweidiol: fe'i darganfuwyd gyntaf yn Florida, UDA ym 1991. Canfuwyd y firws i ddechrau mewn poblogaethau draenogiaid y môr mawr gwyllt, ac yna lledaenodd yn raddol i lawer o lynnoedd dŵr croyw a cherbydau.
Symptomau clinigol pysgod heintiedig
A: Bas mawr mawr, mae'r saeth yn nodi'r sac melynwy; B: draenogyn mawr heintiedig mawr, mae'r saeth yn dynodi'r sac melynwy.
Ffynhonnell y trosglwyddiad yn aml yw ffrio heintiedig neu bysgod oedolion, cyrff dŵr llygredig, a physgod gwyllt sy'n cario'r firws; Gellir trosglwyddo'r firws hwn trwy gyswllt uniongyrchol, ysgarthiad fecal, a chyrff dŵr, ac mae'n fwy tebygol o ddigwydd o dan ansawdd dŵr gwael neu amodau bridio dwysedd uchel. trylediad. Gall y firws achosi syrthni, crwydro, chwyddo abdomenol ac ystumio'r corff mewn pysgod ieuenctid, yn ogystal â chymell wlserau necrotig a gwaedu aml-organ. Ar ôl ei heintio, mae'r gyfradd marwolaethau yn fwy na 90%.
Symptomau clinigol micropterus salmoides sydd wedi'u heintio'n artiffisial
A: Bas mawr mawr; B, C, D: Bas mawr artiffisial wedi'i heintio.
Bob blwyddyn, mae mwy na 30% o ffrio micropterus salmoides yn cael eu colli oherwydd MSRV. Ar hyn o bryd, mae'r dulliau triniaeth a chanfod ar gyfer y firws yn dal i fod yn anaeddfed, ac nid oes meddyginiaeth benodol i'w drin. Felly, mae'n angenrheidiol iawn canfod y firws mewn amser cyn haint a chymryd mesurau ataliol effeithiol, a all leihau'r colledion yn y broses fridio i raddau;
Yn ogystal, mae'n anodd gwneud canfod ar y safle heb offer canfod cymhleth gyda'r dechnoleg canfod bresennol. Yn wyneb yr her hon, mae tîm ymchwil Prifysgol Amaethyddol De Tsieina wedi datblygu dull canfod newydd sy'n cyfuno MIRA â CRISPR-System. Mae gan y dull hwn benodolrwydd cryf, sensitifrwydd uchel a gweithrediad syml, sy'n gwella effeithlonrwydd canfod MSRV yn fawr a hefyd yn helpu i ganfod MSRV mor gynnar â phosibl a chymryd mesurau atal a rheoli.
Sgrinio cyfuniad mira primer
Defnyddiwyd dau bâr o wahanol brimynnau Mira i ymhelaethu ar y darn genynnau sy'n cynnwys y dilyniant targed, ac roedd y cynhyrchion chwyddedig yn destun electrofforesis gel agarose. Roedd y graff electrofforesis wedi'i leoli yn safle 100 bp, ac ymddangosodd bandiau llachar ym mhob un o'r tair lôn, gan nodi bod cynhyrchion ymhelaethu amhenodol. Dadansoddwyd y bandiau targed chwyddedig ar 250 bp yn lonydd 2 a 3 yn feintiol yn feintiol gan feddalwedd Image J, a mynegwyd canlyniadau'r dadansoddiad meintiol gan "werth llwyd". O ganlyniadau'r dadansoddiad, gellir dod i'r casgliad mai'r isaf yw'r gwerth llwyd, yr uchaf yw'r gyfradd defnyddio primer, hynny yw, yr uchaf yw'r effeithlonrwydd ymhelaethu rhwymo penodol primer.
Dangosodd y canlyniadau fod yr effeithlonrwydd ymhelaethu rhwymo penodol yn uchel pan ddefnyddiwyd y pâr primer MIRA-F2/R2.
Sgrinio Pâr Primer Mira Electrofforesis Delwedd Gel a Dadansoddiad Gwerth Llwyd
a. Lane Electrofforesis M: Marciwr DNA 2000 bp; Lôn Electrofforesis 1. Ymhelaethiad sampl DNA negyddol; Electrofforesis Lôn 2. Mae pâr primer MIRA-F1/R1 yn chwyddo'r darn targed (224 bp fel y dangosir yn y blwch); lôn electrofforesis 3. Mae pâr primer Mira-F2/R2 yn chwyddo'r darn targed (255 bp fel y dangosir yn y blwch); b. Dadansoddiad gwerth llwyd band (fel y dangosir yn y blwch)
System Canfod CRISPR/CAS13A
Ar ôl i ymateb system ganfod CRISPR/CAS13A gael ei gwblhau, mae'n cael ei arbelydru â golau uwchfioled i arsylwi ar y canlyniadau.
System Canfod CRISPR/CAS13A Diagram disgleirdeb fflwroleuedd
1-3. Ychwanegwyd y system gyfan gyda safon RNA; 4. Dim crRNA wedi'i ychwanegu; 5. Ni ychwanegwyd protein CAS13A; 6. Ni ychwanegwyd unrhyw stiliwr gohebydd ssRNA; 7. Rheolaeth Negyddol
CRISPR/CAS13A-MSRV System Ymateb Gorau
Gwnaethom gynnal arbrofion gan ddefnyddio safonau RNA a chwyddo RNA sampl. Roedd cyflymder lleoli'r RNA targed yn well gyda CRRNA2 na gyda CRRNA1. Roedd gan CRRNA1 signal fflwroleuedd terfynol cryfach na CRRNA2. Gallai'r defnydd cymysg o crRNA 1+ crRNA2 mewn cyfrannau cyfartal gyfuno manteision y ddau a sicrhau gwell effeithlonrwydd ymateb.
Optimeiddio amodau adweithio canfod CRISPR/CAS13A-MSRV a chanlyniadau canfod
a. Cymhariaeth o ganlyniadau canfod RNA safonol gan ddefnyddio crRNA gyda gwahanol ddilyniannau spacer;
b. Cymhariaeth o ddata signal fflwroleuedd RNA safonol a ganfyddir gan y system ganfod ar dymheredd gwahanol;
c. Cymhariaeth o ddata signal fflwroleuedd RNA safonol a ganfuwyd gan ddefnyddio stilwyr gohebydd RNA gyda chrynodiadau gwahanol;
d. Cymhariaeth o ganlyniadau canfod RNA safonol a ganfuwyd gan ddefnyddio cyfadeiladau stiliwr CAS13A/CRRNA gyda chymarebau crynodiad gwahanol;
Er mwyn archwilio effaith tymheredd adweithio ar y system ganfod, gosodwyd tymereddau adweithio gwahanol o 31 gradd, 34 gradd, 37 gradd a 41 gradd. Y tymheredd ymateb gorau posibl o system canfod CRISPR/CAS13A-MSRV oedd 37 gradd.
Er mwyn archwilio effaith crynodiad stiliwr gohebydd ssRNA ar y system ganfod, o fewn yr ystod prawf, roedd cydberthynas gadarnhaol rhwng y dwyster fflwroleuedd â chrynodiad stiliwr gohebydd SSRNA. Nid oedd effaith canfod crynodiad stiliwr gohebydd ssRNA lawer yn wahanol yn 500-700 nmol/l. O ystyried y problemau economaidd gwirioneddol, y crynodiad stiliwr gohebydd SSRNA gorau posibl oedd 500 nmol/L.
Er mwyn archwilio effaith gwahanol gymarebau crynodiad adwaith CAS13A a CRRNA ar y system ganfod, pan oedd cymhareb CAS13A: crRNA yn 4: 1 a 3: 1 yn seiliedig ar gymhareb 100 nmol/L y gyfran, cyrhaeddodd Cas13a dirlawnder; Pan oedd faint o Cas13a yn gyson, nid oedd cydberthynas gadarnhaol rhwng dwyster y signal fflwroleuedd â'r cynnydd yn faint o crRNA. Felly, pan fydd cymhareb CAS13a i crRNA yn 2: 1, gall system canfod CRISPR/CAS13A-MSRV gyflawni'r gweithgaredd canfod mwyaf.
Gwerthuso Sensitifrwydd
Er mwyn archwilio crynodiad canfod lleiaf MSRV gan system canfod CRISPR/CAS13A-MSRV, gwanhawyd y safon RNA 10 gwaith mewn cyfres a'i chanfod gan system canfod CRISPR/CAS13A-MSRV. Gall system canfod CRISPR/CAS13A-MSRV ganfod o leiaf 100FM o RNA targed MSRV. Pan fydd y crynodiad RNA targed yn is na 100FM, nid yw'r signal fflwroleuedd a ganfyddir gan y peiriant yn sylweddol wahanol i signal y rheolaeth wag. Felly, gall system canfod CRISPR/CAS13A-MSRV ganfod o leiaf 100FM o ssRNA MSRV.
Gwerthuso penodoldeb System Canfod CRISPR/CAS13A-MSRV ar gyfer MSRV
Profi Sampl
Ar gyfer samplau pysgod sâl gydag arwyddion amlwg o salwch a gasglwyd o ffermydd bas y môr, gwnaethom wirio a oedd y pathogen a heintiwyd gan y pysgod sâl yn MSRV. Gwnaethom ddefnyddio primers sy'n benodol i ddilyniant protein capsid MSRV ar gyfer ymhelaethu PCR, ac anfon y bandiau cyfatebol yn y diagram electrofforesis i'w profi. Ar ôl cymhariaeth, gwnaethom gadarnhau mai MSRV ydoedd.
Cadarnhad o wybodaeth dilyniant MSRV
a. Ymhelaethiad PCR o fand cynnyrch 228 bp o brimynnau MSRV; b. Dilyniant protein capsid MSRV o'i gymharu â NCBI, mae dilyniannau beiddgar i fyny'r afon ac mae safleoedd rhwymo primer i lawr yr afon, ac mae ardaloedd cysgodol yn lleoliadau targed ar gyfer rhwymo crispr/Cas13a-msrv crRNA1
Cafodd y samplau pysgod heintiedig sydd wedi'u heintio â MSRV eu pretreated a'u preamplau ar gyfer RNA firaol, ac yna eu profi gyda'r grŵp rheoli negyddol. Ar yr un pryd, tynnwyd cDNA y samplau i'w cymharu â qPCR confensiynol. Roedd y samplau positif (Rhif 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 a 15) a ganfuwyd gan system canfod CRISPR/CAS13A-MSRV yr un fath â chanlyniadau qPCR confensiynol, lle'r oedd gwerth CQ qPCR rhwng 18 a 25; Er bod nifer y cylch trothwy o samplau negyddol (Rhif 1, 2, 4, 5, 9, 10 ac 11) yn fwy na 38, gan nodi nad oedd y samplau yn cario firws MSVR. I grynhoi, roedd data canfod system canfod CRISPR/CAS13A-MSRV a'r RT-qPCR confensiynol yn gyson, gan nodi bod system canfod CRISPR/CAS13A-MSRV yn ymarferol ac yn gallu disodli'r dulliau canfod confensiynol a chymhleth gwreiddiol i raddau penodol.
Siart Cymhariaeth Fertigol Sampl Data Canfod qPCR gyda qPCR a CRISPR
a. Canfod qPCR o ddiagram rhif cylch trothwy sampl glinigol MSRV; Cymharwyd y rhif cylch sampl a ganfuwyd â rhif y cylch cyfeirio negyddol gan ddefnyddio dadansoddiad profion T (** P.<0.01);
b. Cas13A wedi'i gyfuno â chanfod MIRA o ddiagram fflwroleuedd sampl clinigol MSRV; Cymharwyd y gwerth fflwroleuedd sampl a ganfuwyd â'r gwerth fflwroleuedd cyfeirnod negyddol gan ddefnyddio dadansoddiad profion-t (** p<0.01)
I grynhoi, nid oes angen offer arbrofol drud ar y dull canfod CRISPR/CAS13A-MSRV a sefydlwyd yn yr astudiaeth hon, gan wneud canfod ar y safle yn gyflym, yn gywir ac yn gyfleus. Felly, os yw'r dull canfod hwn yn cael ei ddefnyddio i ddarganfod MSRV yn amserol yn y broses fridio wirioneddol a chymryd mesurau wedi'u targedu ac effeithiol, gall leihau'r colledion a achosir gan afiechydon yn y broses fridio yn fawr. Yn ogystal, mae'r dull canfod hwn yn gyflym, yn hynod sensitif ac yn benodol, ac mae ganddo ragolygon cymhwyso a hyrwyddo gwych.