Mae berdys glaswellt yn rhywogaeth economaidd bwysig yn niwydiant dyframaethu dŵr croyw Tsieina. Fodd bynnag, yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae'rMicrosporidium hepatopancreatig(EHP), mae paraseit sy'n heintio hepatopancreas y berdys, wedi cael effaith ddifrifol ar y diwydiant. Gan nad oes cyffur na brechlyn effeithiol ar hyn o bryd i drin y clefyd hwn, mae canfod cyflym a chywir yn hanfodol i atal ei ledaenu.
A.magniified 9. 0 × 1 0 3 gwaith; B. chwyddo 5.0 × 104 gwaith.
Qiao Yi, Shen Hui, Wan Xihe, Fan Xianping, Jiang GE, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie. Ynysu ac arsylwi morffolegol ar microsporidium hepatopancreatig yn Litopenaeus vanNamei. Journal of Fishey Sciences of China, 2018, 25 (5): 1051-1058. Doi: 10.3724/sp.j.1118.2018.17430.
Mae canfod EHP yn dibynnu'n bennaf ar ddulliau bioleg foleciwlaidd, gyda thechnoleg PCR y mwyaf cyffredin. Fodd bynnag, er bod PCR yn cynnig sensitifrwydd uchel, mae angen offer PCR drud ac amgylchedd labordy arbenigol arno, sy'n golygu ei fod yn anaddas i'w ddefnyddio ar y cae. Er mwyn mynd i'r afael â'r mater hwn, datblygodd y tîm ymchwil ddau ddull canfod cyflym yn seiliedig ar dechnoleg MIRA. Mae'r dulliau hyn yn cynnig sensitifrwydd uchel, ymateb cyflym, a gweithrediad hawdd, gan alluogi canfod EHP yn effeithlon ac yn gyflym mewn berdys ar y safle heb yr angen am offer labordy cymhleth, a thrwy hynny lenwi'r bwlch mewn dulliau canfod cyfredol.
Adweithyddion ymhelaethu a ddefnyddir yn yr astudiaeth:
- Pecyn Ymhelaethu Cyflym Isothermol DNA (Sylfaenol)
- Pecyn Ymhelaethu Cyflym Isothermol DNA (Math o Stribed Aur Colloidal)
Mae technoleg MIRA yn ddull ymhelaethu asid niwclëig cyflym aml-ensym. Mae ei egwyddor graidd yn cynnwys gweithredu cydgysylltiedig proteinau swyddogaethol lluosog ar dymheredd amgylchynol i sicrhau ymhelaethiad asid niwclëig cyflym, gan alluogi canfod asid niwclëig gwirioneddol gludadwy, ar y safle.
Dulliau Ymchwil
Echdynnu Sampl
Casglodd y tîm ymchwil samplau berdys glaswellt heintiedig ac iach o dair fferm berdys yn nhalaith Liaoning, gan dynnu DNA o hepatopancreas y berdys.
Dyluniad Primer
Dyluniwyd tair set o brimynnau Mira yn targedu genyn protein serine S8 o EHP (rhif derbyn GenBank: ar 182063). Mae gan y genyn hwn safleoedd gweithredol unigryw, gan sicrhau penodoldeb canfod.
Canfod Mira-oed a mira-lfd
(A) Tymheredd adwaith RPA-oes wedi'i optimeiddio. M: Marciwr DL 500; N: rheolaeth negyddol; Straen 1-5: 25 gradd, 30 gradd, 37 gradd, 39 gradd, a 42 gradd.
(B) Amseroedd ymateb RPA-oed optimaidd. M: Marciwr DL 500; N: rheolaeth negyddol; 1: 10 mun; 2: 20 mun; 3: 30 mun; 4: 40 mun.
(C) Tymheredd adwaith RPA-LFD wedi'i optimeiddio. N: rheolaeth negyddol; 1: 25 gradd; 2: 30 gradd; 3: 37 gradd; 4: 39 gradd; 5: 42 gradd.
(D) Amseroedd ymateb RPA-lfd wedi'i optimeiddio. N: rheolaeth negyddol; 1: 5 mun; 2: 10 mun; 3: 20 mun.
Defnyddiwyd y ddau ddull canfod Mira, Mira-oed (electrofforesis gel agarose) a mira-lfd (immunoassay llif ochrol aur colloidal), i ganfod EHP. Optimeiddiodd y tîm ymchwil dymheredd ac amseroedd yr adwaith trwy arbrofi. Ymhelaethodd Mira-oedran y DNA targed mewn 30 munud ar 37 gradd, tra bod Mira-LFD wedi cwblhau ymhelaethiad mewn dim ond 10 munud ar 37 gradd, gyda'r canlyniadau'n ddarllenadwy o fewn 5 munud.
Canlyniadau arbrofol
Penodoldeb a sensitifrwydd
(A) Penodoldeb canfod oed RPA. M: Marciwr DL 1000; P: Nosema Bombycis; 1: EHP; 2: Enseffalitozoon; 3: microsporidia; 4: firws syndrom smotyn gwyn; 6: annormal; N: Rheolaeth negyddol.
(B) Penodoldeb canfod RPA-LFD. P: Nosema Bombycis; N: rheolaeth negyddol; 1: EHP; 2: Enseffalitozoon; 3: microsporidia; 4: firws syndrom smotyn gwyn; 6: annormal.
(C) Sensitifrwydd RPA-oed gyda gwanhau graddiant plasmidau ailgyfunol. M: Marciwr DL 500; N: rheolaeth negyddol; 1: 4.7 × 10^5 copi/µl; 2: 4.7 × 10^4 copi/µl; 3: 4.7 × 10^3 copi/µl; 4: 4.7 × 10^2 gopi/µl; 5: 4.7 copi/µl; 6: 4.7 copi/µl.
(D) Sensitifrwydd RPA-LFD gyda gwanhau graddiant plasmidau ailgyfunol. N: rheolaeth negyddol; 1: 4.7 × 10^5 copi/µl; 2: 4.7 × 10^4 copi/µl; 3: 4.7 × 10^3 copi/µl; 4: 4.7 × 10^2 gopi/µl; 5: 4.7 copi/µl; a 6: 4.7 copi/µl.
Dangosodd yr arbrofion fod gan dechnoleg MIRA benodolrwydd uchel, gan ganfod EHP yn gywir heb ymateb i bathogenau eraill. O ran sensitifrwydd, roedd gan y ddau ddull derfyn canfod o 4.7 copi/µl, yn sylweddol uwch na sensitifrwydd PCR traddodiadol.
Profi Sampl Glinigol
Dangosodd canlyniadau profi 30 o samplau clinigol fod gan Mira-oed a Mira-LFD gyfradd positifrwydd o 70%, ychydig yn is na qPCR 80%ond yn sylweddol uwch na 56.7%PCR traddodiadol.
Rhagolygon Cais
Mae dulliau canfod wedi'u seilio ar MIRA yn caniatáu ar gyfer ymhelaethu'n gyflym ar enynnau targed ar dymheredd cyson. Yn benodol, gall y dull mira-lfd sicrhau canlyniadau mewn dim ond 10 munud heb yr angen am offer labordy cymhleth, gan ei wneud yn ddelfrydol i'w ddefnyddio ar y safle mewn ffermydd berdys. Mae sensitifrwydd uchel a phenodoldeb y dechnoleg hon yn ei gwneud yn offeryn effeithlon ar gyfer canfod a rheoli EHP yn gynnar, a thrwy hynny amddiffyn iechyd a datblygiad y diwydiant ffermio berdys glaswellt.
Ymhlith y dulliau hyn, mae'r immunoassay llif ochrol aur colloidal (MIRA-LFD) yn arbennig o addas ar gyfer cymwysiadau ar y safle oherwydd ei symlrwydd a'i ganlyniadau greddfol. Gall ffermwyr berdys glaswellt ganfod ac ymateb i heintiau EHP yn gyflym, gan wella galluoedd rheoli clefydau, hybu effeithlonrwydd ffermio yn sylweddol, a lleihau colledion economaidd.