Mae rheolaeth tiwnadwy ar weithgaredd Cas12 yn hyrwyddo canfod asid niwclëig un pot yn gyffredinol ac yn gyflym
Cyhoeddwyd gan: Prifysgol Gwyddoniaeth a Thechnoleg Tsieina
Cyfnodolyn: Nature Communications
Ffactor Effaith: 14.7
Gan ddefnyddio technoleg MIRA, datblygwyd dull canfod asid niwclëig fflwroleuol pot un cyffredinol (SURVEY) yn seiliedig ar sodiwm heparin. Mae astudiaethau wedi dangos y gall sodiwm heparin reoleiddio gweithgaredd holltiad Cas12a trwy ymyrryd â phroses rhwymo crRNA Cas12a. Trwy addasu'r crynodiad sodiwm heparin, mae SURVEY yn gydnaws â dilyniannau PAM clasurol ac is-optimaidd ac mae'n berthnasol i isdeipiau Cas12 lluosog. Mae'r dull hwn, gydag amser canfod o ddim ond 15-20 munud, yn cyflawni sensitifrwydd a phenodoldeb o fwy na 95% ar gyfer canfod ffugfeirws brech y mwnci, firws ffliw A, a SARS-CoV-2. Mae'n gost isel ac yn darparu dull canfod pwynt gofal newydd ar gyfer diagnosis maes meddygol a monitro amgylcheddol, gan fynd i'r afael â'r cydbwysedd anodd rhwng sensitifrwydd a phenodoldeb mewn diagnosteg CRISPR traddodiadol.
1. Astudiaeth ar fecanwaith gweithredu sodiwm heparin
Ychwanegwyd stiliwr fflwroleuol at y system Cas12a-crRNA sy'n cynnwys DNA targed 10nM, a gwelwyd signal fflwroleuol cyflym ac arwyddocaol heb ychwanegu sodiwm heparin. Pan ychwanegwyd 0.2ug/ml sodiwm heparin, roedd y signal fflwroleuol yn debyg i un y grŵp rheoli, sy'n dangos bod sodiwm heparin yn atal gweithgarwch holltiad traws Cas12a. 0.2ug/mL o sodiwm heparin yw'r crynodiad ataliol lleiaf. Wrth i'r crynodiad o sodiwm heparin gynyddu o 0.2ug/mL i 0.5ug/mL, mae gweithgaredd holltiad cis-Cas12a yn cael ei atal yn raddol, ac ar 0.5ug/mL, mae'r gweithgaredd holltiad traws bron yn gyfan gwbl atal. Mae astudiaethau ar fecanwaith gweithredu sodiwm heparin wedi dangos bod y grwpiau o sodiwm heparin â gwefr negyddol yn ymyrryd â rhwymiad cywir crRNA i Cas12a, a gallant effeithio ar ffurfio'r cymhleth deuaidd crRNACas12a.
- MIRA-Cas12a one-canfod pot
Ar ôl dilysu mecanwaith gweithredu sodiwm heparin, archwiliodd y papur strategaeth canfod un pot (MIRA-Cas12a), a oedd yn cyfuno mwyhad MIRA a chanfod fflworoleuedd cyfryngol Cas12a mewn un tiwb.
Yn absenoldeb heparin sodiwm, ni chynhyrchodd y cyfuniad MIRA-Cas12a unrhyw signal fflworoleuedd arwyddocaol o fewn yr ystod crynodiad genynnau targed o 0.1aM i 10fM. Ar 40µg/mL o heparin sodiwm, gwelwyd signal fflworoleuedd sylweddol ar draws yr ystod crynodiad targed o 1aM (≈0.6 copi/μL, cyfaint=30μL) i 10fM (≈6,000 copi/μL, cyfaint=30 μL), gan ddangos gwelliant o dros 1000 mewn sensitifrwydd sodiwm, gan ddangos gwelliant o dros 1000 mewn system synhwyro sodiwm. heparin.
Crynodiad templed firws brech y mwnci oedd 10 fM, a defnyddiwyd Cas12a-crRNA (100 nM) i ganfod y genynnau targed f31 a b6r. Daeth yr adwaith mwyhau i ben ar 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, ac 20 munud, a dadansoddwyd cynnwys cynnyrch ymhelaethu MIRA ar wahanol adegau ar geliau agarose. Yna dadansoddwyd y cynhyrchion canlyniadol ar geliau agarose o dan dri gosodiad gwahanol: MIRA-sodiwm heparin heb Cas12a, MIRA-Cas12a heb sodiwm heparin, a MIRA{{20}Cas12a gyda sodiwm heparin. Dangosodd y canlyniadau, yn absenoldeb sodiwm heparin, fod mwyhad asid niwclëig wedi'i rwystro oherwydd gweithgarwch holltiad uchel cis{-Cas12a. Fodd bynnag, cynyddodd ychwanegu sodiwm heparin yn sylweddol fwyhad asid niwclëig oherwydd gostyngiad yng ngweithgaredd holltiad cis Cas12a.
Mae'r erthygl yn dangos y gellir cyflawni dull canfod asid niwclëig fflwroleuol un pot cyffredinol (SURVEY) yn seiliedig ar heparin sodiwm gan ddefnyddio dilyniannau PAM clasurol a PAM is-optimaidd. Yn ogystal, yn ogystal â LbCas12a, mae AsCas12a ac AapCas12b hefyd yn cael eu defnyddio'n helaeth mewn dulliau CRISPR-Dx. Yn y system sy'n defnyddio MIRA-AsCas12a, dim ond ym mhresenoldeb sodiwm heparin 40ug/mL y gwelwyd fflworoleuedd, sy'n dangos y gall ganfod 1fM o enynnau f31 a b6r. Yn absenoldeb heparin sodiwm, gall MIRA-AapCas12b ganfod genyn 1 f31 a b6r. Roedd gweinyddu heparin sodiwm 20ug/mL nid yn unig yn cyflymu cyfradd ganfod MIRA-AapCas12b, ond hefyd yn gwella dwyster fflworoleuedd. Mae'r canfyddiadau hyn yn dangos bod yr un dull pot a ddatblygwyd gan ddefnyddio dos sodiwm heparin hefyd yn berthnasol i isdeipiau Cas12 eraill.
