《Datblygu Nofel Cas13A/CAS12A-gyfryngolDeuol "un-pot" assay canfod ar gyfer cnydau a addaswyd yn enetig yn mynegi
Mae cnydau a addaswyd yn enetig wedi'u plannu'n eang ledled y byd, ac mae llawer o wledydd wedi gwella eu mesurau rheoleiddio yn raddol i sicrhau diogelwch cnydau a addaswyd yn enetig. Mae datblygu dulliau canfod genetig cyflym a chywir ar y safle yn bwysig iawn ar gyfer amaethyddiaeth a bioddiogelwch, a gall leddfu pryderon y cyhoedd am gynhyrchion a addaswyd yn enetig.
Yn yr astudiaeth hon, datblygodd y grŵp ymchwil adwaith un pot newydd -- canfod deuol mira wedi'i gyfuno â CRISPR deuol (dull MR-DCA) ar gyfer canfod ar yr un pryd CAMV35s a thargedau genetig NOS mewn cnydau a addaswyd yn enetig, gan ddarparu dull canfod syml ac effeithlon ar gyfer cnwdio canfyddedig yn y genetig.
Dulliau arbrofol
Dadansoddir cynnyrch deuol MIRA gan system ddeuol CAS13A a CAS12A i gynhyrchu dau signal annibynnol nad ydynt yn ymyrryd â'i gilydd, ac yna mae'r lliw fflwroleuol yn cael ei ddarllen gan offeryn goleuo neu gan stribed prawf gyda dwy linell T i gyflawni darlleniad sianel ddeuol. Mae'r broses gyfan wedi'i chwblhau mewn llai na 35 munud, gyda therfyn canfod mor isel ag 20 copi.
(Egwyddor canfod MR-DCA o CAMV35S a NOS)
Rhennir yr arbrawf cyfan yn dri cham: ymhelaethiad MIRA, adwaith CRISPR, a dau ddull o ddehongli canlyniadau.
Defnyddir y genyn CAMV35S fel targed CAS13A, a defnyddir y genyn NOS fel targed CAS12A. Dyluniwyd dau bâr o brimynnau Mira yn y drefn honno. Mae'r system CAS13A yn cydnabod RNA yn unig, felly mae'r rhanbarth primer ymlaen wedi'i ddylunio, sy'n cynnwys hyrwyddwr T7 ar gyfer trawsgrifio ac actifadu CAS13A dilynol. Ychwanegir PAM at y genyn NOS. Mae'r ychwanegiadau uchod yn sicrhau y gall proteinau CAS13A a CAS12A rwymo i'w crRNAs priodol, ac nid oes ymyrraeth nac traws-ymateb rhwng y ddwy system.
Sefyllfa arbrofol
Sensitifrwydd a phenodoldeb
Gwanhawyd y sampl mewn graddiant i brofi dwyster fflwroleuedd adwaith Mira. Canfuwyd y gellid dal i ganfod y dwyster fflwroleuedd mewn crynodiad sampl o 20 μl. Dewiswyd y crynodiad o 20 μl o'r diwedd ar gyfer yr arbrawf.
(Defnyddir gwahanol grynodiadau sampl a stribedi prawf ar gyfer datblygu lliw a chyfrifo meintioli dwyster)
Er mwyn gwerthuso ymhellach benodoldeb MR-DCA, profodd y tîm ymchwil samplau cymysg o anifeiliaid nad ydynt yn drawsenig a phlanhigion nad ydynt yn drawsenig. Dangosodd y canlyniadau mai dim ond samplau trawsenig sy'n cynnwys CAMV35S a NOS oedd â signalau fflwroleuedd uchel, tra bod dwyster fflwroleuedd samplau eraill yn agos at y rheolaeth negyddol. Gellir defnyddio MR-DCA fel platfform canfod asid niwclëig targed deuol penodol.
Profwyd 24 o samplau cnwd gan MR-DCA. Yn eu plith, mae 1, 2, 15, 16, 21, a 22 yn ŷd trawsenig sy'n cynnwys hyrwyddwr CAMV35S. Mae 7, 8, 23, a 24 yn reis trawsenig sy'n gwrthsefyll afiechydon sy'n cynnwys Terminator NOS. Mae 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17, a 18 yn ffa soia trawsenig sy'n cynnwys hyrwyddwr CAMV35S a therfynydd NOS.
(Canlyniadau profion 24 sampl)
Ymateb cyflym
Mae amser ymateb yn ffactor pwysig wrth ganfod ar y safle. Sylwodd y tîm ymchwil y gallai offeryn fflwroleuedd ganfod signalau fflwroleuedd FAM a HEX pan oedd yr amser ymateb yn 10 munud. Roedd Mira ynghyd ag adwaith CRISPR hefyd yn arsylwi fflwroleuedd melyn ar ôl 15 munud.
(Signal fflwroleuedd ar wahanol amseroedd ymateb mira)
(Datblygiad lliw y stribedi prawf ar wahanol amseroedd ymateb mira a'r cyfrifiad meintioli dwyster)
Casgliad Arbrofol
Dangosodd y canlyniadau arbrofol fod gan y MIRA deuol benodolrwydd da ac y gallant gael cynhyrchion ymhelaethu CAMV35S a NOS yn gywir. Mae'r systemau CAS13A a CAS12A yn ymateb yn annibynnol heb ymyrryd â'i gilydd. Gall y prawf MR-DCA ganfod 20 copi yn gywir ar dymheredd isel o 35 munud, sydd â gwerth mawr wrth ganfod cnydau a addaswyd yn enetig yn y maes.
Gwybodaeth Erthygl
Enw'r Cyfnodolyn: 《Journal of Advanced Research Express
Teitl yr erthygl: 《Datblygu nofel Cas13A/Cas12A-gyfryngol "un-pot" Assay Canfod Deuol ar gyfer Cnydau wedi'u haddasu'n enetig Express
Ffactor Effaith: 11.4
Tîm Ymchwil: Wang Xiaofu, Academi Gwyddorau Amaethyddol Zhejiang